硅胶基质色谱柱的使用与维护
◆色谱柱到货后
★打开柱包装
每根色谱柱的包装中均衬有泡沫材料以减少运输过程中的振动，而且附有此色谱柱的测试谱图，其中详细记录了测试条件和所得结果。这些信息可用于柱性能的最初验证以及当柱老化时进行故障排除。测试谱图上还包含有关发货时柱中溶剂、压力上限、填料批号、pH范围、色谱柱的产品号和序列号。这些数字用于查对有关信息，比如原始柱性能、装填方法和制造日期。
★色谱柱安装
所有HPLC柱在发货之前都经过测试，以确保满足严格的质量控制(QC)要求。柱外死体积可使本来高效的色谱柱看似效率不高。为使柱外死体积降至最低，您的系统应配备一段短的小孔管(内径为0．005—0．01英寸)和零死体积接头。记住：随着HPLC柱内径的减小，柱外效应变得更为明显，且更有害。
用流动相冲洗泵及管路，以确保从系统中除去污染和气泡。一旦完成上述步骤，即可连接柱子。
HPLC压力要求表明：不管是不锈钢接头、PEEK接头还是碳增强型PEEK接头都可用于整个系统。PEEK接头的使用更为简便它通常设计成带一个滚花螺母，只需用手拧紧即可密封而无泄漏。当拧松时，卡套回到初始状态，故在每次连接时它都能重新定位。PEEK卡套及接头可多次重复使用，并能置于不同深度的接头中而不会导致泄漏或柱效降低。
与PEEK卡套不同，不锈钢卡套仅能用于不锈钢管并在第一次连接时就挤压在管上。目前这种卡套管连接有一个固定末端深度，且仅用于卡套能挤压上去的接头类型。通常模糊的概念是使用不锈钢接头时的拧紧量要求。通常，对于六角螺母，先用手拧紧，再用扳手将螺母旋转1／2圈即可成功地连接。
★色谱柱测试
在与产生最初质量控制色谱图相同的条件下测试柱可确认柱性能。公司可免费提供一些测试混合物(正相及反相)。不过，对于那些含有不稳定化合物的测试混合物，我们建议您直接从化学公司购买单一的化合物。为了尽可能消除误差，按照测试谱图上表明的详细流动相条件及仪器参数进行测试。但色谱系统可能不同，因此，您的测试结果可能与我们实验室所得结果不同。泵及混合体系的不同可能引起操作压力及保留时间的差异。一般来说，变化小于20％可归因于仪器不同。检测器特性，如谱带宽度及光程可能改变蜂高的大小及比率。检测器衰减应调成使色谱峰在量程范围内。
当取得一个良好色谱图后，可计算出柱效及蜂对称性，若手工测量，应使用较快的记录纸速度，为得到最佳准确度，通常纸速应为3cm／min。若您的测试结果与初始测试色谱图有差异，请记住：柱效结果反应的是系统整个组件的性能，并非仅是柱性能。
由于进样器设计、连接管、流动池设计以及检测器与记录仪电子元件等导致的谱带展宽都对总蜂宽有贡献。我们公司提供的色谱柱柱是在柱外效应降至最低的仪器上测试的。这样做并非要得到太高或不现实的塔板数，而是要确保我们的质量控制过程反映的是柱性能，而不是色谱柱／仪器系统的综合性能。若您得到的塔板数低于测试色谱图显示值的l 0--20％，则柱外效应可能是主要问题。
硅胶基质色谱柱的使用与维护
◆色谱柱的维护与使用
★流动相推荐
为获得最长的柱寿命，应避免使用不互溶的或有害的流动相。在选择和配制流动相时，应考虑下面几点：
1、决不要用不相溶的溶剂依次通过色谱柱。
确保即将泵入柱中的溶剂及目前在柱中的溶剂完全相溶，否则必须泵入一种或多种互溶的中间溶剂于
柱中，以免产生高压。
例如，当您想在反相应用中采用正相柱，而该正相柱是在己烷：乙醇=95：5的流动相条件下测试及运
输的，则必须在流动相进入柱之前，泵人中间溶剂，如：异丙醇，异丙醇既与已烷／乙醇混合物相溶，
也与反相法中常用的典型极性溶剂相溶(参见相溶表)。
2、在流动相中只用纯溶剂。
制备流动相时，必须用高纯(HPLC级)溶剂。缓冲盐及离子对试剂中存在的痕量污染物在其它应用中可
能不会产生问题，但若用于HPLC流动相中，则会导致严重的结果。
使用不纯流动相会产生基线漂移或出现污染峰，特别是采用梯度洗脱时。痕量杂质也会吸附于柱头上，
导致分辨率下降及柱寿命缩短。所有溶剂使用前都必须过滤并脱气。
3、注意一旦加入有机溶剂时缓冲溶液可能出现沉淀。
当在流动相中使用缓冲液、离子对试剂或其它盐时，应注意有机物含量增加时会出现沉淀。例如，当
前分析所用流动相组成为乙腈：缓冲液(50：50)，而您希望将已腈含量增至60％，请先在烧杯中试配
乙腈/缓冲液为60：40的混合物，若出现混浊，则表明所加入的有机物含量已引起缓冲液中盐的沉淀。
要避免这种情况出现，就应使用较低摩尔浓度的缓冲液或较少的已腈。
4、不要使用能与键台相或硅胶发生化学反应的流动相。
大多数情况下，HPLC中使用的键合相相当稳定，一般而言，硅氧键将官能团键合至硅胶粒上，强酸
条件下可能会出现硅氧键的水解，故流动相的PH值应保持在2.0(注意：有些色谱柱耐受限可达PH1.0)
以上。若绝对必要，也可用到PH2以下，但柱寿命将会缩短.
氨基键合相(NH 2)特别活泼。应避免使用醛和酮，因为它们会与氨基络合。
HPLC中使用的硅胶或多或少溶于水中，其溶解度强烈地依赖于pH值。在碱性条件下，硅胶特别易于
溶解。大多数硅胶基HPLC填料可使用的pH值高达7.5。使用这一规则必须慎重，因为流动相溶解硅
胶的能力随着存在于缓冲液中盐的浓度及特性、操作柱温及键合相类型而改变。
通过影响硅胶被润湿的难易程度，键合相的特性决定填料的溶解度。反相填料通过在硅胶粒周围提供
一种蜡状疏水层来减少流动相与硅胶的接触，从而保护硅胶表面。键合相越疏水，保护作用越明显。
因此C18相比C4相的保护作用更好。覆盖率也影响保护效果。低覆盖率的键合相柱比高覆盖率柱更快
地降解。由于离子交换剂、裸露硅胶、氨基及氰基固定相对基质硅胶保护极少或根本没有保护，因此，
它们最易溶于水溶性流动相中。 (见“延长柱寿命”)。
硅胶基质色谱柱的使用与维护
★压力限定（接上页）
为最大限度延长柱寿命，操作压力应最小。装填过程中采用的压力表明，很高压力可被承受，但是，日常分析时柱反压应保持在3000psig以下。
可使用在线过滤器以捕集微粒，否则这些微粒会堵塞柱入口筛板，从而导致压力增加。我们可提供不锈钢型或无金属型在线过滤器。
流动相的流速及粘度也影响柱压，理想情况是，粘度应保持在0.5cP以下，
记住：梯度洗脱过程中流动相组成改变时，粘度和压力也改变。
常规使用推荐流速
|
内径 |
流速 |
内径 |
流速 |
|
1.0nun |
0.05m1／min |
4.6mm |
1.0m1／min |
|
2.1mm |
0.2m1／min |
10mm |
5.0m1／min |
★柱平衡
在分析所用流动相引入色谱柱之前，要试验与储存／测试溶剂的相容性，可能需要用一种中间溶剂冲洗色谱柱，详见“流动相推荐”一节。
平衡时间随键合相及流动相性质而改变，用20倍柱体积的流动相洗脱可使反相柱达到平衡。正相柱的平衡时间较长(至少50倍柱体积)，取决于水在流动相中的量。为确保良好的重现性及较快的平衡时间，应在流动相中加入少量的、且比例恒定的水。
★柱储存
HPLC柱必须储存于合适溶剂中并拧紧柱帽，置于阴凉处，避免振动。储存前，通过使用10—20倍柱体积的，不含盐的流动相冲洗以将任何盐或离子对试剂从填料床中清除。例如，需要用甲醇：缓冲液(40：60)时，应当用甲醇／水(40：60)冲洗。
用100％水冲洗将排斥疏水官能团，导致它们“平置”并捕集缓冲液的盐。表
2列出了不同类型HPLC柱的合适柱储存溶剂。
|
储存柱使用的溶剂 |
|
反相* C1，C2，C3，C6，C8，C18，苯基 |
甲醇：水(50：50) |
|
正相 硅胶、CN、NH2、PAC、NO2 |
己烷 |
|
正相w／水相流动相*
硅胶、CN、NH2、PAC、NO2、
N(CH3)2、糖、氧化铝、二醇 |
甲醇 |
|
离子交换** |
甲醇水(10：90) |
*如果使用缓冲液，首先用30—60m1流动相(其中缓冲液已用水代替)冲洗。
**再使用前，用30—50m1水冲洗。
硅胶基质色谱柱的使用与维护
◆延长柱寿命
希维公司提供的柱采用优化方法装填，以得到均匀稳定的填充床。有时，样品或流动相中的污染物会导致柱压升高或柱降解，以下措施将有助于避免柱损坏。
★保护柱和饱和柱
不管柱的制造性能多么优良，来自样品或流动相的污染物在柱中聚集，或硅胶基质的溶解，任何柱都将破坏。我们强烈推荐采用预柱，并且在适当的情况下采用硅胶饱和柱以使损坏降至最低限度。
★ALL Guard（TM）预柱系统
ALL—Guard预柱系统作为分析柱的延伸，其作用在于捕集来自于样品或流动相的、通常能保留于分析柱头的组分。一旦预柱填料被污染，可廉价而方便地更换掉。
若预柱的选择性与分析柱不匹配，则性能会降低。会导致保留时间、分离度及峰对称性都变坏。
ALL—Guard系统通过采用与分析柱匹配的填料装填预柱以避免上述问题的产生。
ALL—Guard系统有三个密封表面及三个部件，这种极简单的设计不易出现泄漏，与其它预柱相比，A11—Guard系统的安装、使用及维护都更为方便（见图11）。独特的A11—Guard柱卡套一侧打开，以便快速安装。只要将预柱放入，用手拧紧螺母，然后与您的分析柱相连接即可。预柱总是可以看见的，使您能及时发现问题所在。A11—Guard卡套及预柱采用小直径流路以保持分离效率。使用每个预柱卡套附带的A11tech柱偶联器，直接将预柱连至您的分析柱。
★硅胶饱和柱
HPLC中使用的硅胶粒在一定程度上溶于水性流动相。随着使用时间的延长，填料将溶解，从而导致柱反压增高，死体积增加及分离度下降。溶解的程度取决于流动相的pH值、缓冲液盐的类型及浓度、操作温度及键合相类型。为使这种效应降至最低，可在泵与进样器之间安装硅饱和柱(图12)。典型的预饱和柱为25cm长、内径4．6mm，填有40—60 u的多孔硅胶。当流动相通过饱和柱时，它溶解足够的硅胶，已达到或接近饱和点。当流动相进入分析柱时，几乎没有再溶解填料的能力了。
当采用键合相或离子交换填料与水性流动相时，使用饱和柱很重要。若流动相的pH值为7或更高时，我们强烈推荐任何硅胶基质柱都应使用饱和柱。
★柱清洗／再生步骤
有时HPLC柱需要对填料床进行清洗及再生。采用一系列逐渐增加强度的溶剂洗脱会使溶质失去与柱的吸附并被洗脱出柱外。再生步骤详见所附流程图。每一步骤所用溶剂后的数字为所需该溶剂的柱体积数。
★筛板的更换
若HPLC的柱反压增加(比正常柱压降还高300psig)就表明筛板出现堵塞。用流动相或再生溶剂反向冲洗柱，使入口筛板的微粒流至废液瓶。若压力仍然居高，更换筛板常可奏效。
|
